IPS诱导肠类器官的培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制

• (1) 将hPSCMediumSupplement在2-8℃解冻，熔化后上下摇动混匀，按实际用量分装，立即使用或存放于-20~-80℃，避免反复冻融。
• (2) 按1:50的比例将10mL的hPSCMediumSupplement加入500mL的hPSCMediumBasalMedium中，充分混合以制成人多能干细胞培养基（尊龙凯时编号abs9403）。注意：混合后的培养基可在2-8℃稳定保存2-3周，不建议使用超过3周的培养基。
• (3) 实验试剂的预处理：人多能干细胞培养基在实验前应置于室温避光平衡，PBS和消化液等应加热至37℃。注意：培养基中含有活性因子，不要在37℃水浴中加热。

二、操作方法（无菌条件下进行）

尊龙凯时hPSC细胞复苏步骤：

• 1. 基质胶包被培养板：取6孔板/12孔板，每孔加入1mL/0.5mL基质胶（尊龙凯时编号abs9410），轻轻摇动使其完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1-2小时，实验前取出并在超净工作台中室温平衡20分钟。若暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，使用期限为1周。
• 2. 预备2-3mL的干细胞培养基放入15mL离心管中备用。
• 3. 解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动以在1-2分钟内迅速解冻。注意：减少细胞在室温下暴露的时间。
• 4. 离心：解冻后，逐滴将冻存液加入含干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。
• 5. 重悬：离心后去除上清，加1mL人多能干细胞培养基，对沉淀进行吹吸混匀，重复3-5次。
• 6. 接种：将平衡好的基质胶弃掉，将均匀的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补全至2mL培养体系。
• 7. 培养：接种后在倒置相差显微镜下观察细胞密度和团块大小，具备4个以上细胞的团块为合格。轻轻晃动6孔板以确保细胞均匀分布，并置于37℃、5% CO2的培养箱培养。第二天观察细胞贴壁情况。
• 8. 换液：从复苏时间起，每24小时更换一次培养基，因活性成分仅足够维持一天，需及时使用新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）传代培养

尊龙凯时实验操作步骤：

• 1. 清洗：吸掉原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇动，随后沿皿边吸去PBS。
• 2. 消化：在6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（尊龙凯时编号abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟。消化时间依据细胞密度调整，通常为2-5分钟。
• 3. 吹打：消化后吸掉消化液，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪轻柔吹打，以脱落细胞集落，并转移至15mL离心管中。
• 4. 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。
• 5. 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，补全至2mL培养体系。
• 6. 换液：自传代时间起，每24小时更换一次培养基，确保新鲜培养基的及时使用。

多能干细胞（PSCs）冻存

尊龙凯时实验步骤：

• 1. 清洗：与传代步骤相同。
• 2. 消化：与传代步骤相同。
• 3. 吹打：与传代步骤相同。
• 4. 离心：与传代步骤相同。
• 5. 重悬：离心后去掉上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（尊龙凯时编号abs9412）混匀，转移至冻存管中。
• 6. 记录：在冻存管上标记细胞种类、冷冻时间、操作者及细胞批次。
• 7. -80℃冰箱冻存：冻存管需直立放置于-80℃冰箱中过夜。
• 8. 液氮冻存：24小时后将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

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