粒曼专注于提供细胞体外基因敲除解决方案，特别致力于针对细胞基因敲除的定制服务。当前，我们提供以下细分的敲除服务，欢迎咨询粒曼团队以获取技术路线及成功案例资料。

精准与模糊敲除服务

尊龙凯时提供真核细胞体外基因敲除的定制服务，我们的团队定期更新Q&A，以便更好地为客户提供服务。我们的Q&A版本【2503】涉及多个基因敲除定制服务相关问题，欢迎详细了解：

服务指南 | 尊龙凯时高通量基因敲除定制服务（RNP法）

常见问题解答

第21问：如何验证基因敲除是否成功？

第22问：精准敲除与模糊敲除的区别？

• 精准敲除：通过同源重组（HDR）机制，在目标基因中引入精确修饰（如特定片段删除、点突变或插入），由此部分或完全失活基因功能。这种方法的实验策略通常不同于传统的基因敲除。尊龙凯时提供的精准敲除服务能够针对靶基因的特定区域进行精准的核苷酸序列敲除、敲入及突变。
• 模糊敲除：利用非同源末端连接（NHEJ）机制，在目标基因指定区域随机引入插入或缺失突变（Indel），从而导致基因编码框的移位或终止密码子提前出现，最终破坏基因功能。

第23问：CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围是多少？理论上，CRISPR/Cas9可以敲除1kb至1Mb范围的片段，结合多靶点切割技术或其他技术（如CRISPRa/i、表观遗传修饰）可实现超大片段的敲除。

第24问：如何提高原代细胞的编辑效率？可以通过以下几种方式：

• 使用病毒载体，如慢病毒或AAV，将其整合进基因组中。
• 电场诱导以穿孔细胞膜，适用于贴壁或悬浮的原代细胞（需优化参数）。
• 直接将Cas9-RNP导入核内，特别适用于难转染细胞（如原代T细胞）。
• 利用脂质纳米颗粒包裹Cas9-sgRNA复合物，以提高转染效率，适用于原代肝细胞和成纤维细胞。

第25问：如何提高基因敲除效率？

第26问：如何分析基因敲除后的表型变化？

第27问：如何区分纯合敲除与杂合敲除？

第28问：CRISPR RNP法适用的细胞和场景有哪些？

结语

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法通过将多条化学合成或生物合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（RNP），并以电转化或脂质体转染的方式“瞬时”递送到细胞内，能够实现高效且稳定的基因编辑，避免传统病毒载体的相关问题。由于RNP在细胞内完成基因组编辑后会迅速降解，因此不会引入外源序列，从而尽可能保持细胞表型，降低脱靶效应。

尊龙凯时的CRISPR/Cas9 RNP法进行基因敲除细胞系的构建已经在路上，预计将全面替代传统的基因编辑方式。