尊龙凯时提供了一套免疫荧光实验的详细方案，适用于研究人员在生物医学领域中探索细胞和组织的分子特征。以下是此实验方案的重要步骤和注意事项。

一、甲醛固定的免疫荧光实验步骤

A. 溶液与试剂

请使用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液：

• 1×磷酸缓冲盐水（PBS）：要配制1L的1×PBS，加入100ml的10×洗涤缓冲液和900ml的dH2O，混匀后调整pH至8.0。
• 4%甲醛（无甲醇）：使用新鲜溶液。
• 封闭缓冲液：添加0.5ml与二抗同一物种来源的正常血清（如正常山羊血清）以及30µL Triton X-100到95ml的1×PBS中，制备1×PBS/5%正常血清/0.3% Triton X-100缓冲液，存放在4°C。
• 抗体稀释缓冲液：将0.1g BSA和30µL Triton X-100加入到10ml的1×PBS中，制备1×PBS/1%BSA/0.3% Triton X-100缓冲液，存放在4°C。
• 荧光素偶联的二抗：选择对您的一抗宿主物种（如兔子）具有反应性的二抗，确保其适用于免疫荧光实验。

B. 固定步骤

所有后续孵育均需在室温（20-25°C）下进行，除非另有说明。

1. 进行冷冻组织的免疫染色处理。
2. 对于培养的细胞系或未固定的冷冻组织切片，请按如下方式立即进行固定：
1. 用4%甲醛覆盖样品至2-3mm的深度。
2. 在室温下固定15分钟。
3. 用PBS漂洗三次，每次5分钟。
4. 继续进行免疫染色操作。

C. 免疫染色步骤

1. 在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。
2. 在抗体稀释缓冲液中制备一抗，并参照产品网站获得建议的稀释范围。
3. 吸出封闭溶液，加入稀释后的一抗，并在4°C下孵育过夜。
4. 用1×PBS漂洗三次，每次5分钟，若使用荧光标记的一抗可直接跳到步骤8。
5. 使用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本1-2小时。
6. 用1×PBS漂洗三次，每次5分钟，并请确保避光处理。
7. 进行适当的复染。同时，可参考荧光细胞染料的产品页面，获取推荐实验步骤。
8. 安装样品进行成像。
9. 为了长期保存样品，请在4°C下避光保存。

二、甲醇固定的免疫荧光实验步骤

A. 溶液与试剂

本步骤同样使用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水准制作溶液：

• 1×磷酸缓冲盐水（PBS）：配制方法同上。
• 100%甲醇：使用冰冷的溶液。
• 封闭缓冲液：可直接购买即用型免疫荧光封闭液，或按前述方法制备。
• 抗体稀释缓冲液：制备方法和贮存条件同上。
• 荧光素偶联的二抗：确保其适用于免疫荧光法。

B. 固定步骤

1. 吸出培养基，并用冰冷的100%甲醇覆盖2-3mm的细胞。
2. 在冰上或4°C条件下固定15分钟。
3. 用1×PBS漂洗三次，每次5分钟。
4. 继续进行免疫染色操作。

C. 免疫染色步骤

1. 在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。
2. 在抗体稀释缓冲液中制备一抗，并参照产品网站获得建议的稀释范围。
3. 吸出封闭溶液，加入稀释后的一抗，并在4°C下孵育过夜。
4. 用1×PBS漂洗三次，每次5分钟，若使用荧光标记的一抗可直接跳到步骤8。
5. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本1-2小时。
6. 用1×PBS漂洗三次，每次5分钟，并请确保避光处理。
7. 进行适当的复染。同时，可参考荧光细胞染料的产品页面，获取推荐实验步骤。
8. 安装样品进行成像。
9. 为了长期保存样品，请在4°C下避光保存。

三、甲醇通透的免疫荧光实验步骤

A. 溶液与试剂

使用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水准备溶液：

• 1×磷酸缓冲盐水（PBS）：配制方法同上。
• 4%甲醛（无甲醇）：使用新鲜溶液。
• 100%甲醇：使用冰冷溶液。
• 封闭缓冲液：制备方法和贮存条件同上述。
• 抗体稀释缓冲液：制备和贮存方法同上。
• 荧光素偶联的二抗：确保其适用于免疫荧光法。

B. 固定步骤

1. 对固定的冷冻组织进行免疫染色。
2. 对于细胞系或未固定的组织切片，进行相同的固定步骤。

C. 免疫染色步骤

1. 在封闭缓冲液中的封闭步同前述。
2. 进行甲醇通透化步骤，用冰冷的100%甲醇覆盖样品，孵育10分钟。
3. 使用PBS及后续步骤，参照上述免疫染色步骤进行处理。

尊龙凯时致力于为生物医学研究的实验室提供高质量的支持和产品。希望以上免疫荧光实验方案能为您的研究提供帮助，并祝成功！