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尊龙凯时:生物医疗中Co-ip实验技巧与银染考染快捷学习指南

发布时间:2025-09-07   信息来源:尊龙凯时官方编辑

尊龙凯时 Co-IP实验的关键步骤包括裂解液的现场配置及抑制剂的使用。首先,将磁珠轻轻吹打以重悬,然后使用TBS进行三次洗涤。接着,将抗体与磁珠进行预孵育,然后与样本一起过夜反应。在整个过程中,确保将Loading溶液煮沸,使复合物完全形成,并通过离心收集上清液以用于后续实验。整个操作需轻柔进行,并在冰上进行以确保安全。抗体的选择至关重要,特异性良好是成功的关键。

尊龙凯时:生物医疗中Co-ip实验技巧与银染考染快捷学习指南

尊龙凯时 银染实验的基本原理如下:银离子能够与含羧基的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、咪唑(如组氨酸)、疏水基团(如半胱氨酸)及氨基(如赖氨酸)相互作用并结合。在碱性环境中,甲醛将银离子还原为金属银,并使其沉积在蛋白质条带上,从而显示出棕黑色。

实验步骤包括:

1. 固定:用含有乙醇和醋酸的固定液(如50%的乙醇和10%的醋酸)处理电泳后的凝胶,固定时间一般为30分钟至1小时,目的是稳定蛋白质条带,防止扩散和流失。

2. 敏化:使用含有硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)或戊二醛的敏化液处理凝胶,使得蛋白质表面被活化,以便于银离子的结合,敏化时间通常为15至30分钟。

3. 银离子孵育:将凝胶放入硝酸银(AgNO₃)溶液中孵育,使银离子与敏化后的蛋白质结合,时间一般为15至30分钟。

4. 显影:用显影液(通常含有碳酸钠和甲醛等还原剂)处理,促使银离子还原为金属银,形成可见的黑色或深棕色条带,显影过程需密切观察,通常完成于5至15分钟。

5. 停显:使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)或冰醋酸的终止液停止显影,以防止背景染色过深,停显时间一般为10至15分钟。

6. 水洗与保存:最后,用去离子水彻底清洗凝胶以去除残留试剂,随后可进行扫描或拍照记录结果。凝胶可短期保存于水或甘油溶液中。

尊龙凯时 考染实验的基本原理为染料与蛋白质结合时,分子构象发生变化,形成蓝色复合物,并富集在蛋白质表面的疏水区域。凝胶中原本透明的蛋白条带因染料聚集而显现蓝色,主要由染料的磺酸基团与蛋白质中的碱性氨基酸残基(如精氨酸和赖氨酸)之间的静电引力所驱动,同时伴随一些附加的范德华力与疏水相互作用。

实验步骤包括:

1. 准备100ml溶液B,并加入20ml溶液A,混合均匀作为工作液。

2. 将电泳后的PAGE胶(如8x10cm大小)取下,置于容器中,加入50ml双蒸水或去离子水,加热至沸后,在脱色摇床上搅拌5分钟,弃去水相。

3. 加入25ml快速染色工作液,加热至沸腾并保持30至60秒,停止加热后在脱色摇床上摇动8分钟,弃去染色液。

4. 加入约50ml双蒸水,再次加热至沸腾并保持30至60秒,并继续在脱色摇床上摇动8分钟,换水以完成脱色,观察结果。如果显色不明显,可以选择重复染色。

通过以上实验步骤,结合尊龙凯时的先进技术,可以有效优化实验结果,提升实验准确性和效率。